De synthese van DNA


Deze website maakt gebruik van cookies. verberg deze melding

Achtergrond maandag 1 oktober 2001 KNAW/KNCV

De synthese van DNA

DNA was al in de 19e eeuw bekend, maar pas in jaren vijftig werd ontdekt hoe het in elkaar zit. In de periode daarna deed de Nederlander J.H. van Boom baanbrekend werk aan de synthese van DNA

door

DNA werd in 1869 door Friedrich Miescher ontdekt. Toch duurde het tot 1943 voor Avery aantoonde dat nucleïnezuren zoals DNA en RNA dragers zijn van erfelijke informatie. Voor die tijd veronderstelden de meeste wetenschappers dat niet DNA maar eiwitten de genen vertegenwoordigden. Om meer inzicht te verkrijgen over de wijze waarop de erfelijke eigenschappen van organismen vastliggen, moest in de eerste plaats de structuur en eigenschappen van nucleïnezuren worden opgehelderd.

Bekend was dat ze uit lange ketens van nucleotiden (de bouwstenen) bestaan, die op hun beurt weer zijn samengesteld uit een suiker, een fosfaatgroep en verschillende stikstofbevattende basen. De twee nucleïnezuren DNA en RNA kunnen van elkaar worden onderscheiden op grond van het type suiker dat zij bevatten, ribose voor RNA en deoxyribose voor DNA.

Structuuropheldering

Omstreeks 1950 was de wetenschappelijke race naar de structuuropheldering van DNA in volle gang. DNA werd met röntgendiffractie bestudeerd. De diffractiepatronen waren onduidelijk en aangenomen werd dat afhankelijk van de hoeveelheid water, DNA kan voorkomen in een A en een B vorm, twee sterk op elkaar lijkende structuren.

De revolutie in dit veld vond in 1953 plaats toen Watson en Crick een artikel publiceerden waarin zij stelden dat DNA een rechtsdraaiende helix structuur vormt, bestaande uit twee ketens die elkaar via waterstofbruggen tussen de stikstofbevattende basen kunnen herkennen. Op deze wijze kan een DNA-keten als matrix dienen voor een andere, zodat DNA zich tijdens de celdeling kan dupliceren zonder van structuur te veranderen. Dit voorstel verklaarde alle toen bekende gegevens en werd algemeen geaccepteerd.

Deze ontdekking, een van de belangrijkste van de twintigste eeuw (bekroond in 1962 met de Nobelprijs voor Geneeskunde), was een bron van inspiratie voor het onderzoek naar nucleïnezuren. Een belangrijke doelstelling was om de structuur van DNA en RNA nog nauwkeuriger vast te stellen. Er werd intensief onderzoek gedaan naar de bereiding van nucleïnezuren. Op deze wijze zou immers DNA of RNA met een bekende lengte en volgorde verkregen kunnen worden. Aldus zou men kristallen kunnen maken en de exacte structuur vaststellen.

Figuur 1. 3-D DNA/RNA-model Bron: Archief Natuur & Techniek

Pionier prof. A.R. Todd

Een belangrijke pionier was professor A.R. Todd aan de universiteit van Cambridge (Engeland). Onder zijn leiding werden diverse methoden voor de synthese van dinucleotiden (een fragment van twee bouwstenen) onderzocht. Toen in 1968 dr. J.H. van Boom zich bij Prof. Lord Todd meldde, was een definitieve synthese van dinucleotiden (laat staan voor langere fragmenten) nog niet in zicht. Van Boom werkte in Cambridge intensief samen met professor dr. C.B. Reese, grondlegger van de zogenaamde fosfortriestermethode voor de synthese van nucleïnezuren.

Gewapend met de in Engeland opgedane kennis werd Van Boom in 1970 door de universiteit van Leiden in de gelegenheid gesteld een onderzoeksgroep op te bouwen met als doel de synthese van nucleïnezuren. De benodigde fosforyleringsreacties moesten worden versneld, en tevens moesten verschillende nevenreacties worden vermeden.

Omstreeks 1976 was men in staat 25 mg van enkele zuivere oligonucleotiden van zes tot tien basen te bereiden. De synthese van een dergelijk fragment kostte een ervaren onderzoeker minstens vier maanden.

Kristallen

Aan het eind van de zeventiger jaren werden verschillende samenwerkingsprojecten opgesteld met moleculair biologen en fysisch chemici. Met professor A. Rich (MIT, USA) werd onderzoek verricht naar de exacte structuur van DNA.

Verschillende fragmenten werden in Leiden gemaakt, waarvan men in Boston kristallen liet groeien. Spoedig werden van het hexanucleotide dCGCGCG kristallen van de juiste kwaliteit verkregen. Het was echter niet eenvoudig om de structuur van deze verbinding op te lossen. Lang werd er vanuit gegaan dat dit molecuul de bekende rechtsdraaiende A of B helixstructuur van DNA bezat. Uiteindelijk bleek dat men hier voor het eerst met een linksdraaiende helix te maken had. Er werd een totaal nieuwe structuur, het zogenoemde Z-DNA, ontdekt. De verbazing die deze ontdekking wekte, betrof deels de nauwkeurigheid waarmee de posities van de atomen kon worden vastgesteld, maar vooral de vondst dat DNA meer verschillende vormen kan aannemen. Ook de aanwezigheid van andere moleculen, zoals geneesmiddelen die een interactie kunnen aangaan met DNA, bleek invloed te hebben op de structuur.

Figuur 2. J.H. van Boom Bron: J.H. Van Boom, Oegstgeest

Restrictie-enzymen

Rond die tijd werd ook belangrijke vooruitgang geboekt op het gebied van de moleculaire biologie. Een daarvan was de vondst van de zogenoemde restrictieenzymen, eiwitten die in staat zijn een specifieke volgorde in DNA te herkennen en te knippen. Daarnaast werden enzymen geïsoleerd die een breuk in DNA kunnen repareren. Omdat complementaire DNA-fragmenten elkaar herkennen, werd hiermee de mogelijkheid geschapen om genetisch materiaal te veranderen. Voor dit type onderzoek is de hoeveelheid DNA van minder belang, terwijl het snel beschikbaar hebben van een groot aantal verschillende DNA-fragmenten juist essentieel is.

Naar aanleiding hiervan gingen de DNA-synthetici zoeken naar een zogenaamde vaste-drager-synthese. Deze benadering houdt in dat de eerste bouwsteen wordt vastgezet aan een onoplosbaar polymeer, waarna de volgende bouwstenen één voor één worden vastgeknoopt. Deze werkwijze heeft niet alleen als voordeel dat de arbeidsintensieve zuiveringsstappen worden vermeden, maar de snelheid van de reacties kan ook worden verhoogd.

Bovendien kan een eenmaal ontwikkelde vaste-drager-synthese worden geautomatiseerd. Overal op de wereld werd naarstig gezocht naar een geschikt polymeer en vooral een effectieve fosforylerings techniek.

DNA-synthesizer

De inspanningen leverden spoedig succes op. In 1983 schafte de inmiddels hoogleraar geworden Van Boom, als eerste in Nederland, een DNA-synthesizer aan. Van Boom is een gedreven syntheticus die het liefst in het laboratorium bezig is. Samen met zijn rechterhand dr. G.A. van der Marel pakte hij deze nieuwe tak van onderzoek voortvarend aan. Na verloop van tijd kon binnen een dag een fragment van zestien nucleotiden lang en van voldoende kwaliteit worden gemaakt. Een groot aantal onderzoeksgroepen in binnen- en buitenland werd vanuit Leiden voorzien van zuivere DNA-fragmenten. Met behulp van dergelijk nauwkeurig gedefinieerde DNA fragmenten werd veel kennis verkregen over de structuur en eigenschappen van nucleïnezuren.

Zo werd niet alleen het inzicht in het mechanisme van replicatie van virussen vergroot, maar ook ontdekt hoe antitumor geneesmiddelen als cis-platina en daunomycin binden met DNA. Daarna werd veel onderzoek verricht om de geautomatiseerde DNA-synthese te optimaliseren.

Omstreeks 1990 was de bereiding van DNA-fragmenten op een zodanig niveau dat gebruikersvriendelijke apparaten op de markt kwamen. Op het ogenblik is zoveel vooruitgang geboekt dat vrijwel elke onderzoeker de synthese van een nucleïnezuurfragment tot een lengte van honderd basen kan realiseren door enkele toetsen van het toetsenbord in te drukken.

Zie ook:

Literatuur:

  • S. Neidle, Oxford Handbook of Nucleic Acid Structure, Oxford University Press, Oxford (1998).
  • A.H.J. Wang, G.J. Quigley, F. Kolpak, J.L. Crawford, J.H. van Boom, G.A. van der Marel en A. Rich, Molecular Structure of a lefthanded double helical DNA fragment at atomic resolution. Nature 282 (1979), p. 680.
Dijken

Dit artikel is afkomstig uit het boek Chemie achter de dijken, een gezamenlijke uitgave van de Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen (KNAW) en de Koninklijke Nederlandse Chemische Vereniging (KNCV). Het werd in 2001 uitgegeven ter herdenking van het feit dat de Nederlander Jacobus Henricus Van ‘t Hoff honderd jaar eerder in 1901 de allereerste Nobelprijs voor de scheikunde won. Chemie achter de dijken belicht Nederlandse uitvindingen en ontdekkingen op chemisch gebied sinds 1901. In zo’n zeventig bijdragen (voor het overgrote deel opgenomen in Kennislink) wordt de betekenis van de Nederlandse chemie duidelijk voor ontwikkelingen op het gebied van de gezondheidszorg (bijvoorbeeld de kunstnier), de voedingsmiddelenindustrie (onder andere zoetstoffen), de kledingindustrie (bijvoorbeeld ademende regenkleding) of de elektronica (zoals herschrijfbare CD’s).

Dit is een publicatie van KNAW/KNCV

Kennislink is een uitgave van de Stichting Nationaal Centrum voor Wetenschap en Technologie (NCWT). De activiteiten van NCWT worden mogelijk gemaakt door inhoudelijke en/of financiële bijdragen van onder andere het publiek, het bedrijfsleven, vanuit fondsen en het ministerie van OCW. Kennislink wordt mede mogelijk gemaakt door de bijdragen van de Nederlandse universiteiten, wetenschappelijke organisaties en een groot aantal andere partijen op het gebied van wetenschap en techniek. © 2002–2015 Kennislink / disclaimer


Source: www.kennislink.nl

Wij Samen Posted on December 4th, 2015